事実＝公表資料に記載のある内容（出典リンクあり）
本稿の計算＝明示した前提をもとに本記事が算出した値
未確定／将来＝計画・目標であり、実績が確認できていない事項
このほか、構造の整理や材料・プロセス設計上の読み取りは「解説」として区別しています。

核酸医薬は「配列」だけ見ていると半分しか分かりません。 配列が同じでも、骨格の酸素を硫黄に替えるか、糖の2′位に何を付けるか、末端に何を結ぶかで、 分解のされ方も、たどり着く臓器も、製造と品質管理の難しさも変わります。 Khvorova と Watts は、組織分布と代謝を決める分子の特徴を「ダイアノフォア（dianophore）」と名づけ、 核酸医薬ではそれが「糖・塩基・リン酸骨格の化学修飾、一本鎖か二重鎖かという構造、標的化リガンドの有無」によって大きく規定されると述べています事実。

Robertsらは「ヌクレオチド間リン酸基の非架橋酸素原子のひとつを硫黄で置き換えたホスホロチオエート（PS）結合の導入が、治療用オリゴヌクレオチドで広く用いられている」と述べています事実。

KhvorovaとWattsは「アンチセンス技術に最初に適用された化学修飾は、いまなお最も広く使われている。すなわちホスホロチオエート骨格である」とし、 「もともとはヌクレアーゼ安定性を与えるために導入されたが、ホスホロチオエート修飾の主要な影響は、オリゴヌクレオチドの体内動態と取り込みに現れてきた」と整理しています事実。

Robertsらは、2′-O-メチル（2′-OMe）、2′-O-メトキシエチル（2′-MOE）、2′-フルオロ（2′-F）が最も一般的な2′置換基だとし、これらが 「未修飾RNAの求核的な2′水酸基を置き換えることでヌクレアーゼ耐性を高め、血漿中の安定性、組織中の半減期、ひいては薬効の持続を改善する」と述べています事実。

さらに「これらの修飾は、リボースの3′-エンド型パッカー（RNA様）の配座を促すことで、相補的RNAへの結合親和性も高める」としています事実。 ただし「これらの2′-リボース修飾はRNase H活性と両立しない」ため、立体障害型に使われるか、ギャップマーの両翼に置かれます事実。

Robertsらは、PMO（ホスホロジアミデート・モルフォリノオリゴヌクレオチド）を 「5員環のリボース複素環が置き換えられた、電荷的に中性の核酸化学」と説明しています事実。 糖と骨格の両方を作り替えてしまう設計です。

日本で承認されたビルトラルセン（ビルテプソ点滴静注250 mg）は、PMDA審査報告書で 「モルフォリノ骨格を有する合成オリゴヌクレオチド」、原薬は「21残基のヌクレオチドからなる合成オリゴヌクレオチドであり、白色の粉末」「原薬は非晶質である」と記載されています事実。

論文の記述にしたがって数え直し、鎖長を変えた場合も計算します本稿の計算。

• 前提：n塩基の鎖にはヌクレオチド間結合が n−1 個ある
• 前提：各PS結合が S_p と R_p の2通りをとり、位置ごとに独立とする

計算

• 20塩基（全PS）：2¹⁹ ＝ 524,288通り（論文の「50万を超える」と一致します）
• 18塩基（全PS）：2¹⁷ ＝ 131,072通り
• 21塩基（全PS）：2²⁰ ＝ 1,048,576通り。塩基を1つ足すと、異性体の数は2倍になります
• 末端だけPS化した場合（siRNAで一般的な設計）：PSが6か所なら 2⁶ ＝ 64通り

前提と限界：これは組合せの数え上げであり、実際に各異性体が等量できることを示すものではありません。 また、異性体の数が多いこと自体が品質や安全性の問題を意味するものでもありません。 この数は、次章で見る「単一の化合物として管理できない」という状況を桁で理解するためのものです。

オリゴヌクレオチドは1塩基ずつ伸ばします。 各段のカップリングが完璧でないと、短い鎖（欠落体）が残ります。 1段あたりの収率を変えて、20塩基まで伸びる割合を計算します本稿の計算。

• 前提：20塩基を得るにはカップリングを19回行う
• 前提：各段の収率は等しく、失敗した鎖はその後伸びない（実際には失敗末端はキャップされます）

計算

• 各段 98%：0.98¹⁹ ＝ 約68%
• 各段 99%：0.99¹⁹ ＝ 約83%
• 各段 99.5%：0.995¹⁹ ＝ 約91%
• 40塩基で各段99%なら：0.99³⁹ ＝ 約68%。同じ収率でも、鎖を倍にすると粗製品の純度は20塩基の98%相当まで落ちます

Andrewsらは実際の製造について「80%を超える粗純度は珍しくない」と記しており事実、 上の「各段99%」に近い水準です（本記事による対照）。 前提と限界：この計算は等収率という単純化にもとづくもので、実際の不純物プロファイルを示すものではありません。

PMDAの審査報告書は、ビルトラルセンの原薬について 「原薬は、モルフォリン環上の炭素原子及び20個のリン原子上に不斉中心を有するジアステレオ混合物である」と記載しています事実。

そして類縁物質の扱いについて、申請者の説明としてこう記されています。 「オリゴヌクレオチド類縁物質は相互に類似した化学的性質を有しているため、個々に分離して分析することが困難である。そのため……ロット間の不純物プロファイルは一貫していることから、純度試験で用いる HPLC 分析において……検出される不純物群として管理することが適切と考える」事実。

原薬の規格には含量、性状、確認試験（UV/VIS、IR、MS）、pH、純度試験［溶状、類縁物質（HPLC）、残留溶媒（GC）］、水分、エンドトキシン、微生物限度、定量法（HPLC）が設定され、 重要工程として合成・精製の複数工程が指定されています事実（具体的な工程名やパラメータは審査報告書で非公開部分となっています）。

Robertsらは「GalNAcは、肝臓で高発現するアシアロ糖タンパク受容体1（ASGR1）に高い親和性（K_d ＝ 2.5 nM）で結合する糖部分であり、エンドサイトーシスによってアンチセンスやsiRNAを肝細胞へ取り込ませることを促す」と説明しています事実。

受容体の性質も要点です。「ASGR1は肝臓で非常に高く発現しており、細胞膜へ速やかにリサイクルされるため、肝臓を標的とする効果的な送達にとって理想的な受容体となっている」事実。

外れ方も設計されています。「GalNAcとASGR1の相互作用はpH感受性であり、エンドソームの酸性化の過程で受容体とオリゴヌクレオチド複合体の解離が起こる。続いてGalNAc部分が酵素的に分解され、オリゴヌクレオチドが遊離する」事実。

同論文は、GalNAc結合が現在の主要な戦略になっている理由を 「高い肝サイレンシング能、ナノ粒子複合体に比べた小ささ、明確に定まった化学組成、低い合成コスト」と列挙しています事実。

効力の向上幅についても数値が示されています。 「GalNAc結合はマウスにおいてアンチセンスの効力を約7倍高め、それは肝臓に特異的であった。ヒトの患者では約30倍であった」事実。 また「GalNAc結合アンチセンスは生体内で肝細胞に優先的に送達され、一方で未結合のアンチセンスは主に肝臓の非実質細胞で検出される」とされています事実。

同論文は、GalNAc結合siRNAでラットに見られた肝毒性について、要旨でこう述べています。

「過剰な曝露量で観察されるげっ歯類での肝毒性は、化学修飾やRNAi経路の撹乱ではなく、主としてRNAiを介したオフターゲット効果に帰属できることを示す」事実

そして対策が化学修飾でした。 「これらのオフターゲット効果は、熱的に不安定化する化学修飾を用いてシード対合を調節することによって緩和でき、これはラットにおいてGalNAc-siRNAの安全性プロファイルを有意に改善する」事実。 具体的にはグリコール核酸（GNA）のヌクレオチドを、アンチセンス鎖の7番目に置く方法が示されています事実。

「7塩基の一致」や「11塩基の一致」がどれほどありふれたことなのか、確率で確かめます本稿の計算。

• 前提：4種類の塩基が等確率でランダムに並ぶ配列を考える（実際の配列はランダムではありません）

計算

• 7塩基が偶然一致する確率：1 ÷ 4⁷ ＝ 1 ÷ 16,384。約1万6千塩基ごとに1回現れる計算になります
• 10万塩基ぶんの配列を調べたら：100,000 ÷ 16,384 ＝ 期待値で約6か所
• 11塩基が偶然一致する確率：1 ÷ 4¹¹ ＝ 1 ÷ 約419万
• 19塩基すべてが偶然一致する確率：1 ÷ 4¹⁹ ＝ 1 ÷ 約2,750億。完全一致はまず偶然には起こりません

この対比が、オフターゲットという問題の性質を示しています（本記事による解説）。 「配列を全長で合わせる」設計は十分に特異的なのに、実際に作用してしまうのは短い部分一致である—— だから特異性は、全長の長さでは担保できません。

前提と限界：実際のゲノムや転写産物の塩基はランダムに並んでいないため、この計算は桁の感覚をつかむための概算です。 特定の配列について実際に何か所一致するかを示すものではなく、毒性を評価するものでもありません。

2020年3月30日付けの「核酸医薬品の非臨床安全性評価に関するガイドライン」は、オフターゲット毒性を2つに分けています事実。

• ハイブリダイゼーションに起因するオフターゲット毒性：「標的以外の類似した塩基配列にハイブリダイズすることによる毒性」
• ハイブリダイゼーションに起因しないオフターゲット毒性：「ハイブリダイズを介さずに核酸医薬品の構造及び物理的・化学的性質によって惹起される毒性」

そして評価の方法まで書き分けています。前者については 「ヒトと動物ではゲノム配列が異なることから、ヒトでの安全性を動物試験で追究するのではなく、ヒトのゲノムDNAやRNA情報を用いた in silico 解析、あるいはヒト細胞を用いた in vitro 遺伝子発現解析などを用いて評価することが推奨される」事実。 後者については「核酸医薬品の物性（化学修飾など）によって惹起されることから、化成品の非臨床安全性評価が参考になると考えられる」としています事実。

「一本鎖の治療用オリゴヌクレオチドの製造は、典型的には4つの主要な要素からなる。(1) 固相担体上でのオリゴヌクレオチド合成、(2) 担体からの切り出しと保護基の除去、(3) 分取クロマトグラフィーによる精製、(4) 凍結乾燥による単離である」事実

「オリゴヌクレオチドは、およそ40年にわたってオリゴヌクレオチド合成の主流であり続けてきた固相担体を用いるホスホロアミダイト法によって合成される」事実。 出発物質は「保護されたヌクレオシドから誘導されたホスホロアミダイトのモノマー」です事実。

担体については「歴史的には最初のヌクレオチドを予め担持させた多孔質ガラス（CPG）、より最近ではUnyLinker分子を結合させたポリスチレン」が使われるとされ、 「合成はコンピュータ制御で完全に自動化され、試薬がカラムに順次流される」と記されています事実。

同論文は、原料の原子効率についてこう述べています。 「出発物質の原子効率は低い（たとえば4種のデオキシリボヌクレオシド・ホスホロアミダイトで平均36%）。保護基が広範に使われるためであり、その結果、これらの原料の原子の大部分は原薬に取り込まれず、廃棄物として捨てられる」事実

とくにDMT基について「DMT基は、デオキシ体のホスホロアミダイトの質量のおよそ3分の1に相当する」と指摘し、 より分子量の小さい代替保護基の検討を挙げています。ただし「精製のハンドルとして使うため、最終サイクルではDMT保護されたホスホロアミダイトを使うことが依然として有利であろう」とも述べています事実。

対象はアンチセンスとsiRNAを含む8プロセス（MOE、LNA、cEt などの修飾を含み、開発フェーズも異なる）です事実。

「PMIは 3,035〜7,023 の範囲で得られ、平均は 4,299 であった。これらの値は、低分子（中央値 168〜308）とバイオ医薬品（約8,300）の原薬について算出されたPMIの数値の間に位置する」事実

鎖長で割った値も示されています。「1ヌクレオチドあたりのPMIは 152〜251 の範囲で、平均は 199 である」事実。

PMIの平均値と、承認済み製品の含量から換算します本稿の計算。

• 前提：PMIを4,299（Andrewsらの8品目平均）とする事実
• 前提：ギブラーリ（ギボシラン）は1バイアル1 mL中に189 mgを含む事実
• 前提：レクビオ（インクリシラン）は1シリンジ1.5 mL中に284 mgを含む事実

計算

• 原薬1 kgあたり：4,299 kg ＝ 約4.3トンの原材料
• 189 mg（1バイアル相当）：0.189 g × 4,299 ＝ 約813 g。指先に乗る量の原薬に、800 g超の原材料が対応します
• 284 mg（1シリンジ相当）：0.284 g × 4,299 ＝ 約1.2 kg
• 水の量：PMIの51%が水なら、原薬1 kgあたり 約2.2トンが水になります
• 洗浄溶媒の量：総PMIの25%なら、原薬1 kgあたり 約1.1トン

前提と限界：PMIの平均値を個別製品に当てはめた概算で、これらの製品の実際のPMIではありません。 Andrewsらのデータは開発中の8品目についてのもので、製品名は公表されていません。 ホスホロアミダイトやリガンドの合成分も含まれていません。

• 投与経路は「局所」か「肝臓」に偏っています。眼（硝子体内）、髄腔内、そして皮下・静脈から肝臓へ——Robertsらが「肝臓以外の組織への送達が依然として大きな目標である」とする状況が、承認品の並びにそのまま現れています事実
• siRNAの承認品は、分子量がそろっています。ギボシラン 17,245.56、インクリシラン 17,284.72、ブトリシラン 17,290——いずれも三分岐GalNAc結合siRNAで、質量がほぼ同じです事実。同じ骨格に別の配列を載せていることが数値からうかがえます（本記事による解説）
• アンチセンスは化学の系統が分かれています。2′-MOE・全PS型（ヌシネルセン）と、電荷をもたないPMO型（エテプリルセン、ビルトラルセン）事実
• 保存条件が製品でまったく違います。2〜8℃で凍結不可のもの、2〜25℃のもの、20〜25℃の室温のもの事実。核酸医薬に一律の低温輸送が必要とは言えません（本記事による解説）
• アプタマーは2例です。ペガプタニブとアバシンカプタド ペゴルで、いずれもPEG化され、いずれも眼への局所投与です事実

• 核酸医薬は、標的を配列で決め、届き方を化学修飾で決めます。Khvorovaらはこの分離を核酸医薬の鍵となる利点としています事実
• 全PS化した20塩基の鎖は、524,288通りの立体異性体の混合物になります本稿の計算。厚生労働省の通知は、分布の評価が困難な場合に工程パラメータで恒常性を説明すべきとしています事実
• GalNAcは糖3つで肝細胞に届けます。K_d＝2.5 nMで結合し、エンドソームの酸性化で外れる設計です事実
• オフターゲットは短い部分一致で起こります。7塩基の一致は約1万6千塩基ごとに現れる計算です本稿の計算
• 製造は1塩基あたり4段の反応の繰り返しです。20塩基なら19サイクル・76回の反応、時間にして約14時間本稿の計算
• 材料効率の律速は洗浄です。原薬1 kgに約4.3トンの原材料本稿の計算、うち洗浄溶媒が総PMIの25%を占めます事実