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オフターゲット効果と安全性評価｜iPS細胞・再生医療 技術解説

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TECHNOLOGY EXPLAINER

オフターゲット効果と安全性評価
― 「見つからなかった」は、検出限界つきの主張である

ゲノム編集の安全性評価の中心は、狙った場所以外が編集されていないかです。 ただし実際の評価は「ある／ない」の二択ではありません。 CASGEVYの公開審査報告書では、複数の方法で候補を挙げ、深いシーケンスで確認した結果、確認されたオフターゲット編集はなかったと記載されています事実。 一方、添付文書は「遺伝的変異のため、意図しないオフターゲット編集のリスクは否定できない。その臨床的意義は不明」と書いています事実。 この2つの文は矛盾しません。どこまで見えているかの「感度」と「範囲」が、結論の中身を決めているのです。

構成：FDAガイダンス・添付文書・審査要約（SBRA）、EMA公開審査報告書（EPAR）、PMDA科学委員会報告書、査読論文（Nature Biotechnology／Nature Methods／Science／Nature Genetics など）を一次情報として使用／最終更新 2026年10月

上段はゲノム編集因子が狙ったDNA部位に結合する模式図。下段は別の場所にある似た配列を点線で候補として示し、拡大鏡で調べる様子を描く
Cas9を例にした、狙った部位とオフターゲット候補の概念図（AI生成イメージ）。青緑は狙った部位、黄は別の場所にある似た配列を示します。点線と薄い編集因子は「意図しない編集が起こりうる候補」を表し、実際に編集されたことを示しません。候補は検査で確かめる必要があります。実際のゲノム配列・測定結果・製品を示すものではありません。
この記事の構成
  1. オフターゲットとは何か（3行でつかむ）
  2. 「意図しない編集」は4種類ある
  3. 検出法の地図 ― 候補を挙げる方法と、確かめる方法
  4. 本稿の計算：「見つからなかった」はどこまで言えるか
  5. 素材技術者の視点①：評価系を成り立たせているのは試薬と対照
  6. 実例：CASGEVYの評価を公開審査報告書で読む
  7. 個人差 ― 遺伝的変異が結果を変える
  8. 規制当局の考え方 ― FDA、PMDA、EMA
  9. 低減の工夫 ― ガイド、酵素、時間、方式
  10. 素材技術者の視点②：低減策は「材料設計」の問題
  11. 課題と、確定していないこと
  12. 用語集／参考資料／出典対応表
本記事の表記ルール

事実＝公表資料に記載のある内容（出典リンクあり）
本稿の計算＝明示した前提をもとに本記事が算出した値
未確定／将来＝計画・目標であり、実績が確認できていない事項
このほか、構造の整理や評価設計上の読み取りは「解説」として区別しています。

医療についてのお断り

本記事は評価技術・材料技術の解説です。特定の治療の安全性を判定したり、治療を勧めたり、製品どうしを比べて優劣をつけたりするものではなく、医療上の助言でもありません。 数値は、規制当局の公表資料と査読論文に記載があるものだけを、条件（細胞の種類、評価時点など）とともに引用しています。 ゲノム編集の仕組みそのものは、本シリーズ「ゲノム編集」編で扱っています。

1. オフターゲットとは何か（3行でつかむ）

オフターゲットとは、「狙った場所と似た配列が別の場所にあり、そこで起こる意図しない編集」です。

  • なぜ起きるか：PMDA科学委員会の報告書は、CRISPR/CasではガイドRNAが最大5個のミスマッチがあっても結合しうることが知られており、目的外の遺伝子の切断とそれに伴う挿入・欠失が起きる可能性が高くなる、と述べています事実。Fuらの論文も、標的と最大5塩基違う部位に変異が入りうると報告しています事実
  • 何が懸念されるか：PMDAの報告書は、オフターゲット作用の結果として特に懸念されるのは細胞のがん化であり、がん遺伝子の活性化やがん抑制遺伝子の不活化が起こりうること、ゲノム編集の改変は永続的なので危険性が増す、と整理しています事実
  • どう扱われているか：FDAのガイダンスは、複数の方法（in silico、生化学的、細胞を用いる方法）で、ゲノム全体を対象とした解析を行うよう推奨しています事実。承認時にも、FDAは15年間の観察研究を市販後の必須事項としました事実
この記事でいちばん大事な一行

「検出されなかった」とは、「その方法の感度の下限より高い頻度では見つからなかった」という意味です。 EMAの公開審査報告書では、確認用の深いシーケンスの閾値は初期の試験で1%、後の超深度の試験で0.2%でした事実。 PMDAの報告書は、次世代シーケンサーの誤り率のため、0.1%以下の頻度で起こるオフターゲット作用を検出することは極めて困難と述べています事実。 この記事では、この「下限」が何を意味するかを、公表された数字から確かめます。

2. 「意図しない編集」は4種類ある

「オフターゲット」という言葉は、実際には少なくとも4種類の現象をまとめて呼ぶことが多い言葉です。 FDAのガイダンスは、ゲノム編集特有のリスクとしてオフターゲット編集、オンターゲット編集の意図しない結果、長期影響が不明であることを挙げています事実。 以下は、公表された研究をもとに本記事が整理した4分類です。

「意図しない編集」の4分類（本記事による整理） ※ 各項目の根拠となる研究は本文と参考資料に示します。4つは互いに排他的ではありません。 ① オフターゲット（類似配列の編集） 狙った場所と似た配列で切れる／変わる 最大5塩基違っても起こりうる（Fuら 2014） 検出法：in silico、GUIDE-seq、CIRCLE-seq等 塩基編集では、DNAだけでなく RNAにも意図しない変換が報告されている （Zuoら 2019、Grünewaldら 2019） ② 標的部位での大きな欠失・再編成 狙った場所そのものが、想定より大きく壊れる 数kb〜に及ぶ欠失、複雑な再編成 （Kosickiら 2018、Cullotら 2019） 短い増幅産物のPCRでは見落とす → ロングレンジPCRや長鎖シーケンスで確認 ③ 染色体レベルの異常 染色体の転座、欠失、染色体の腕の脱落 微小核・染色体架橋を経たクロモスリプシス （Leibowitzら 2021、Zuccaroら 2020） 核型分析、FISH、CGHなど それぞれに検出できる範囲の限界がある （PMDA科学委員会報告書） ④ 細胞の応答による選択 切断が細胞のDNA損傷応答（p53）を起動する p53が働く細胞が減り、働かない細胞が残りうる （Haapaniemiら 2018、Ihryら 2018） iPS／ES細胞を含む多能性幹細胞では 著者らがp53機能のモニタリングを推奨 （Ihryら 2018）
図1　概念図（ベクター作図）。各分類は Fuら（2014）［参考資料7］、Zuoら（2019）［参考資料26］、Grünewaldら（2019）［参考資料27］、Kosickiら（2018）［参考資料13］、Cullotら（2019）［参考資料14］、Leibowitzら（2021）［参考資料15］、Zuccaroら（2020）［参考資料16］、Haapaniemiら（2018）［参考資料17］、Ihryら（2018）［参考資料18］、PMDA報告書［参考資料2］によります。4つに分けて並べたのは本記事によるもので、公式の分類ではありません。

② 標的部位での大きな欠失・再編成

Kosickiらは、Cas9による二本鎖切断がしばしば数kbにわたる欠失として修復されることを、マウス胚性幹細胞、マウス造血前駆細胞、ヒトの分化細胞株で示し、切断点から離れた病変や交差イベントも見つけたと報告しています。 著者らは、分裂中の細胞で生じたこのゲノム損傷は病原性の結果をもたらしうると述べています事実。 Cullotらは、1か所の切断だけで、メガベース規模の染色体の切り詰めがp53依存的に起こりうることを、細胞株と初代細胞で報告しています事実。 PMDAの報告書も、DSBの修復過程で数kbにわたる大きな欠失、遺伝子断片の挿入、逆位が生じることが報告されているとし、修復の方向が定まっていないことが原因だと説明しています事実。

③ 染色体レベルの異常

Leibowitzらは、Cas9による切断が核の構造欠陥（微小核、染色体架橋）を生み、極端な染色体再編成であるクロモスリプシスを起こしうることを、モデル細胞と臨床で意味のある遺伝子座・細胞で示しました。 著者らは、これを「オンターゲットの結果として、これまで見過ごされていたもの」とし、臨床応用では広範な染色体再編成の可能性を考慮し、モニタリングすべきだと述べています事実。 Zuccaroらは、ヒト胚でCas9切断後に染色体の片腕または両腕が失われうることを報告しています（胚を用いた基礎研究であり、治療用製品の結果ではありません）事実。

④ 細胞の応答による選択

Haapaniemiらは、Cas9による編集がp53依存のDNA損傷応答と細胞周期停止を起こし、p53経路が機能している細胞に対する選択がかかることを示しました。 著者らは、細胞治療を開発するときはp53の機能をモニタリングすべきだと述べています事実。 Ihryらは、ヒト多能性幹細胞（hPSC）で、Cas9のRNP導入により80%を超える平均インデル効率を得た一方、Cas9が作るDSBは毒性があり、多くのhPSCを死滅させること、その反応はP53/TP53依存であることを示しました。 著者らは、hPSCはP53変異を獲得しうるため、Cas9で操作したhPSCを用いる細胞置換療法は注意して進め、P53機能をモニタリングすべきだとしています事実。 PMDAの報告書も、相同組換え修復を利用したゲノム編集でp53の変異が検出された報告に触れ、p53などの有無を確認する必要があると述べています事実。 iPS細胞を使う再生医療では特に関わりの深い論点です（本シリーズ「iPS細胞」編を参照）。

3. 検出法の地図 ― 候補を挙げる方法と、確かめる方法

オフターゲットの評価は、通常2段階で進みます。まず「どこが切れうるか」の候補を挙げ（ノミネーション）、次にその候補を深く読んで確かめます（確認）。 EMAの公開審査報告書は、CASGEVYの評価をまさにこの「候補の抽出（site nomination）」と「候補の確認（site confirmation）」の2段階として記述しています事実。 PMDAの報告書も、in silico解析だけでなく、実験的手法でヒトゲノム全体にわたって候補サイトを探すことが必要で、その候補で実際に切断や欠失が起きているかをWGSやアンプリコンシーケンスで確認する、という構図を示しています事実。

オフターゲット評価の流れ（概念図） ※ 実際の評価は製品ごとに設計されます。ここでは代表的な構成を、本記事が整理したものです。 ① コンピュータ上で探す（in silico） 配列の類似性から候補を予測する 例：CCTop、CRISPOR、COSMID ② 試験管内で探す（生化学的） 精製したゲノムDNAをCas9で消化する 例：Digenome-seq、CIRCLE-seq、CHANGE-seq ③ 細胞の中で探す（細胞を用いる） 実際に切れた場所を細胞内で捕まえる 例：GUIDE-seq、DISCOVER-seq 段階1：候補の抽出（ノミネーション） 段階2：確認 候補部位を深いシーケンスで読む ハイブリッドキャプチャ アンプリコンシーケンス 全ゲノムシーケンス 頻度の閾値を決めて判定 （例：1%、0.2%） 未処理の対照細胞と比べる 段階3：影響の評価 染色体の異常 核型分析、 ロングレンジPCR、 長鎖シーケンス がん化の可能性 免疫不全マウスでの 腫瘍原性試験 承認後：観察研究（最長15年）と、遺伝的変異を考慮した生物情報学的な追加解析 ※ 各段階の方法はFDAガイダンス、PMDA報告書、EMA公開審査報告書、FDA審査要約に記載のものを例示したものです。
図2　概念図（ベクター作図）。候補の抽出と確認の2段階はEMA公開審査報告書［参考資料4］、方法の例はPMDA報告書［参考資料2］と各手法の原著論文［参考資料8〜12］、市販後の追加解析はFDA審査要約［参考資料3］によります。3段階＋承認後に整理したのは本記事によるものです。
方法どこで見るか原著論文の要旨の記述
in silico（CCTop、CRISPOR、COSMIDなど）コンピュータ（参照ゲノム）PMDA報告書：容易だが不正確。EMA報告書：CCTopは最大5ミスマッチ、COSMIDは挿入・欠失（バルジ）を含む候補も探せる
Digenome-seq（Kimら 2015）試験管内（精製ゲノムDNA）Cas9で消化したゲノムを全ゲノムシーケンスし、切断部位で同じ5′末端をもつリードを探す。0.1%未満のインデルが入る部位も検証
CIRCLE-seq（Tsaiら 2017）試験管内（環状化したゲノムDNA）感度が高く、細胞型に特有の一塩基多型に由来するオフターゲットも同定でき、個人ごとの特異性プロファイルを作れる
CHANGE-seq（Lazzarottoら 2020）試験管内（タグメンテーション）スケール可能・自動化可能。ヒト初代T細胞の13遺伝子座・110標的で201,934か所のオフターゲットを同定。細胞内のオフターゲットは活性なプロモーター・エンハンサー・転写領域の近くで2〜4倍起こりやすい。ヒトの一塩基変異が約15.2%の部位の活性に有意な影響
GUIDE-seq（Tsaiら 2015）細胞内二本鎖オリゴDNAが切断部位に取り込まれることを利用。13種のRGNでオフターゲット活性に大きなばらつき。同定部位の多くは既存の計算法やChIP-seqでは検出されなかった。短縮ガイドRNAでオフターゲットが大きく減った
DISCOVER-seq（Wienertら 2019）細胞内・生体内DNA修復因子MRE11の動員を追跡。細胞株、患者由来iPS細胞、マウスの生体内でオフターゲットを同定
確認：深部シーケンス実際の編集細胞PMDA報告書：全ゲノムシーケンスは正確だが高価で低感度。候補部位をPCR増幅して深く読む方法で感度は読む深さに左右される

すべて事実（参考資料2・4・8〜12。PMDA報告書の表1の評価を含む）。方法名の並べ方と「どこで見るか」の分類は、本記事による整理です。

4. 本稿の計算：「見つからなかった」はどこまで言えるか

確認の段階で使う「深く読む」とは、候補部位1か所あたり、何本のリード（読み取り配列）を集めるかという話です。 EMAの公開審査報告書は、ハイブリッドキャプチャ深部シーケンスの閾値を、初期の試験で1%（中央値カバレッジ2,500超）、後続の試験で0.2%（超深度、10,000×超）としています事実。 この数字から、「閾値」が何を意味するかを計算してみます。

本稿の計算

次の単純化を置きます本稿の計算。

  • 前提1：ある部位のリード数が N本、その部位の真の編集頻度が f のとき、編集を含むリードの期待本数は N × f（シーケンスの誤りは無いと仮定）
  • 前提2：編集を含むリードが1本も見つからなかったとき、真の頻度の95%片側上限はおよそ 3 ÷ N（「3の法則」）
  • 前提3：最小推奨用量は3×10⁶ CD34陽性細胞／kg（添付文書）、体重を60 kgと仮定。細胞は二倍体で、評価した部位は1か所とする

計算

  • 期待リード数：1% × 2,500 ＝ 25本／0.2% × 10,000 ＝ 20本／0.1% × 10,000 ＝ 10本／0.05% × 10,000 ＝ 5本
  • 5本以上読める確率（ポアソン分布）：期待10本なら約97%、期待5本なら約56%
  • ゼロ件のときの上限：10,000本読んで0本 → 3 ÷ 10,000 ＝ 0.03%（2,500本なら 約0.12%）
  • 細胞数に直すと：3×10⁶ × 60 ＝ 1.8×10⁸ 個 → アレル数は3.6×10⁸。頻度0.2%なら 約7.2×10⁵アレル、頻度0.03%なら 約1.1×10⁵アレル

読み取れること：閾値0.2%・深度10,000×は「期待20本」の水準で、誤りと区別できる程度の本数を確保する設計と読めます（本記事の解釈）。 同時に、「検出されなかった」は「頻度が0.03%以下」程度までしか言えず、それでも数十万アレル規模が検出の下に隠れうることもわかります。

前提と限界：実際のシーケンスには誤りがあり、PMDAが述べるとおり0.1%以下の検出は極めて困難です事実。 上の計算は誤りを無視した理想化で、検出の「上限の桁」を示すためのものです。 また、頻度が低い部位が実際に害をもたらすかどうかは別の問題で、この計算はそれを評価するものではありません。 EMAの報告書は、GUIDE-seqで挙がった候補の多くがイントロンまたは遺伝子間領域だったと記載しています事実。

「閾値」を数に直す（本稿の計算を含む作図） シーケンスの誤りを無視した理想化です。桁を示すためのもので、実際の検出能力を保証するものではありません。 25本 閾値1%・深さ2,500× 2,500 × 0.01 初期の確認（EPAR） 20本 閾値0.2%・深さ10,000× 10,000 × 0.002 超深度の確認（EPAR） 10本 頻度0.1%・深さ10,000× 10,000 × 0.001 PMDA：極めて困難な域 5本 頻度0.05%・深さ10,000× 10,000 × 0.0005 5本以上読める確率 約56% ゼロ件のとき、真の頻度の95%上限 ≒ 3 ÷ リード数 10,000本で0本 → 約0.03%　／　2,500本で0本 → 約0.12% 最小用量 3×10⁶個／kg × 60 kg ＝ 1.8×10⁸個（アレル 3.6×10⁸） 頻度0.2% ≒ 7.2×10⁵アレル　／　頻度0.03% ≒ 1.1×10⁵アレル ※ 閾値1%（深さ2,500超）と0.2%（深さ10,000超）はEMA公開審査報告書、最小用量は添付文書の値です。 ※ 期待リード数、ポアソン確率、3の法則による上限、細胞数・アレル数への換算は本記事の計算で、公表値ではありません。 ※ 体重60 kg、二倍体、評価部位1か所は本稿が置いた仮定です。
図3　本稿の計算を含む作図（ベクター作図）。閾値と深さはEMA公開審査報告書［参考資料4］、最小用量は添付文書［参考資料6］、0.1%以下が極めて困難という記述はPMDA報告書［参考資料2］によります。期待リード数・確率・上限・細胞数は本記事が算出したもので、公表値ではありません。実際のシーケンスの誤りや、DNAを取り出す細胞数の制約は考慮していません。

5. 素材技術者の視点①：評価系を成り立たせているのは試薬と対照

素材技術者の読みどころ：評価の結果は、試薬の濃度ひとつで大きく変わる

オフターゲット評価は「測定」ですが、測定そのものが材料と試薬の設計問題です。EMAの公開審査報告書には、その典型が書かれています。

  • タグ用の合成オリゴの濃度：GUIDE-seqは、二本鎖オリゴDNA（dsODN）を細胞に同時に入れ、切断部位に取り込ませて読み出します。EMAの報告書によれば、CD34陽性細胞ではdsODN濃度が1 µMを超えると細胞毒性と、検出される切断部位数の増加が見られました。最初の試験（1 µMを超える濃度を含む）では857か所が検出されましたが、0.5 µM（細胞の生存率70%以上を確保）で別の2ドナーを用いた追加試験では21領域が挙がり、最初の試験との重複はありませんでした事実。ドナーも条件も違うため原因を断定はできませんが、試薬の濃度が候補リストの中身を左右しうることを示す記述です（本記事による解説）
  • 対照が背景を教える：同報告書の核型分析では、240個の分裂中期細胞のうち60個がSPY101‐RNPで処理され、5個に染色体の異常がありました。うち4個は染色体を1〜2本失った細胞で、電気穿孔なしの対照細胞にも同じ種類の異常があり、申請者は標本作製の過程で生じるアーティファクトで、頻度は背景の範囲内としています事実。未処理・模擬処理の対照がなければ、背景ノイズを編集の影響と読み誤ります。FDAのガイダンスも、アッセイの品質と結果の解釈可能性を確認するため、適切な対照を含めるよう求めています事実
  • 試験管内の方法は、DNAの「材料」を選ぶ：PMDAの報告書は、試験管内の酵素反応を用いる方法を「高感度で、一塩基多型も区別できる」一方、「細胞内の反応ではない」と整理しています事実。精製ゲノムDNAは染色体の折りたたみ（クロマチン）がない状態なので、何を再現して何を再現しないかを理解して使い分ける必要があります（本記事による解説）
  • サンプルの量そのものが制約：FDAの審査要約は、候補部位を実際に試験したのは一部の遺伝的変異に限られ、その理由としてサンプルの制約を挙げています事実。患者由来の細胞は材料として有限です

本稿の調査範囲では、オフターゲット評価のための公的な標準物質（参照ゲノム編集試料など）が整備されているかを確認できませんでした。 各評価は、製品ごとに対照と受入基準を組むことが前提になっています未確定／将来。

6. 実例：CASGEVYの評価を公開審査報告書で読む

EMAの公開審査報告書（EPAR）は、CASGEVYのガイドRNA（SPY101）のオフターゲット評価を詳細に記述しています。 一般論ではなく実際の評価がどう組まれ、どこまで見たかが分かる、数少ない公開資料です（数値はすべてEPARの記載で、ヒト造血幹・前駆細胞を用いた非臨床試験の結果です）。

CASGEVYのオフターゲット評価：候補から確認まで（EPARの記載） ※ 数字はEMA公開審査報告書の記載です。図は流れを要約したもので、すべての試験を網羅していません。 候補の抽出 確認（深部シーケンス） 判定 in silico（3つの公開ツール） 配列の類似性から候補を抽出 in silicoで挙がった部位：5,007か所 GUIDE-seq（健常ドナー） 最初の試験（1ドナー）：857か所 0.5 µM・別の2ドナー：21領域 最初の試験との重複なし GUIDE-seq由来の統合 52領域 → 142の切断候補部位 患者細胞のGUIDE-seq SCD 3人＋TDT 3人：64領域 全試料に共通の領域はなし ハイブリッドキャプチャ 初期の試験：閾値1% （中央値カバレッジ 2,500超） 超深度の試験：閾値0.2% （10,000×超）。223か所を 健常4ドナーの細胞で確認 患者細胞での確認 SCD・TDTの患者細胞で、新規の 候補＋既存の223か所を再評価 4つの候補領域が残り、うち2つが 0.2%の閾値で名目上有意 GMPプロセス適格性7ロットも オンターゲット・オフターゲットを評価 健常ドナーとGMPロット 確認されたオフターゲット 編集はなし 7ロットでもオフターゲット 編集の証拠なし 患者細胞の2領域 申請者は真のオフターゲット 部位とはみなさない ・標的との相同性がない ・未処理の対照にも切断 ・単一切断部位の型でない ・第3染色体の反復配列領域 （自然に切れやすい領域） ※ 報告書の総括：「ハイブリッドキャプチャ深部シーケンスでは、実施したどの試験でもオフターゲット編集は確認されなかった」。 ※ 上の「判定」は申請者の判断をEMAが報告書に記載したもので、本記事が評価したものではありません。
図4　概念図（ベクター作図）。すべての数字・条件はEMA公開審査報告書［参考資料4］の非臨床安全性の記載によります。流れを3列に整理したのは本記事によるものです。「判定」欄の理由は報告書が申請者の判断として記載したものです。

同じ報告書は、標的部位そのもの（オンターゲット）の大きな変化も評価しています。 ロングレンジPCRとハイブリッドキャプチャ配列解析を用いて、30塩基対を超える大きな挿入の平均率を4.0%（LR-PCR）と4.7%（ハイブリッドキャプチャ）、30塩基対を超える大きな欠失の平均率を6.3%（LR-PCR）と4.9%（ハイブリッドキャプチャ）と記載しています。欠失の大きさは最大およそ7.5 kb、挿入は最大5.5 kbに及びました事実。 欠失率に両法で有意差があった点については、大きな欠失を含む断片はLR-PCRでより効率よく増幅される傾向があるためと説明されています事実。 つまり、測定法の選び方で、同じ現象の見え方が変わるということです。

FDAの審査要約は、非臨床の結論を次のように書いています。健常ドナー、SCD患者、輸血依存性β‐サラセミア患者のCD34陽性細胞で、in silicoと細胞を用いる解析で挙げた候補部位をハイブリッドキャプチャで確認し、オフターゲット編集は検出されなかった。 一方で、遺伝的変異を考慮した解析では、サンプルの制約のため一部の変異を含む候補部位しか実験的に確認していないことも明記しています事実。

7. 個人差 ― 遺伝的変異が結果を変える

オフターゲット評価の候補は、多くの場合参照ゲノム（標準的な配列）を基準に挙げられます。 しかし、患者の配列は参照ゲノムと同じではありません。

上段は参照ゲノムのDNAでCas9は結合していない。下段は一塩基の違いを黄で示したDNAで、Cas9が結合しうる場所を模式的に描く。拡大部分が異なる一塩基を示す 上段：参照ゲノム（PAMなし） 下段：個人の変異（PAMが生じる場合）
図5　個人の変異がオフターゲット候補を作りうる仕組み（AI生成の概念図）。上段は参照ゲノムの配列、下段は個人の配列です。下段の黄色い一塩基の違いによってPAMが生じ、Cas9が結合しうる部位になる場合を模式的に示しています。この図は編集が実際に起きたことや、特定の患者の配列・測定結果を示すものではありません。次の図6で仕組みを詳しく説明します。

Cancellieriらは、SNP（一塩基多型）と挿入・欠失を考慮してオフターゲットを探すツールCRISPRmeを開発し、臨床試験で有望とされたBCL11Aエンハンサー標的のガイドRNAで検証しました。 その結果、最も有力なオフターゲット候補は、アフリカ系の集団で一般的な（マイナーアレル頻度4.5%）アレルによって作られていました。そのアレルはPAM配列を新たに生み出すものでした事実。 同論文は、SpCas9がCD34陽性造血幹・前駆細胞で厳密にアレル特異的なインデルと動原体周辺の逆位を生じることを確認し、高忠実度Cas9はこのオフターゲットを軽減すると報告しています。 著者らは「遺伝的変異は、ゲノム編集の結果の修飾因子として考慮されるべき」と述べ、変異を考慮したオフターゲット評価が今後の治療用ゲノム編集の評価で欠かせないものになると予想しています事実。

変異がPAMを作ると、「切られない候補」が「切られる候補」になる（概念図） ※ Cancellieriら（2023）の報告の仕組みを模式化したものです。配列や長さは実際のものではありません。 参照ゲノムのアレル 変異をもつアレル PAMなし ガイドRNA（ミスマッチはあるが標的と似た配列） Cas9は切らない → 参照ゲノム基準の候補には挙がりにくい PAM出現 Cas9が切りうる → そのアレルをもつ人だけ、この部位でオフターゲットが起こりうる ※ PAMはCas9が切る前に必要な隣接配列です（本シリーズ「ゲノム編集」編）。変異がPAMを作ることがありうる、という仕組みの例です。
図6　概念図（ベクター作図）。変異がPAMを生み、オフターゲット候補を作るという仕組みは Cancellieriら（2023）［参考資料19］の記述によります。配列の長さ・位置は模式で、実際の部位を示すものではありません。

規制当局の文書にも、この問題は表れています。

  • EMAの報告書：相同性にもとづく候補探索を、1000人ゲノム計画に基づきマイナーアレル頻度10%超、のちに1%超のSNPまで広げて行ったと記載しています事実
  • FDAの審査要約：患者集団の遺伝的多様性を考慮した解析は、米国の限られた人数の配列情報による変異データベースを用いて行われ、変異が作る一部の候補部位は実験的に試験されなかったと記載しています。このためFDAは、市販後の生物情報学的研究を必須としました。具体的には、5つの大陸集団（アフリカ、ヨーロッパ、東アジア、南アジア、アメリカ）のうち少なくとも1つで0.5%以上のアレル頻度をもつすべての変異を用いたin silico解析のやり直しと、新たに挙がった候補部位の確認試験です事実
  • 諮問委員会：FDAの細胞・組織・遺伝子治療諮問委員会が2023年10月31日に、オフターゲットの安全性評価の妥当性を議論しました。議論の中でCPS1の変異（バリアント）のスクリーニングや追加の解析法にも触れられ、投票設問は設けられませんでした事実。この変異がCancellieriらの報告したアレルと同じものかどうかは、公表資料から断定できません
  • 添付文書：5.4項に「遺伝的変異のため、個人のCD34陽性細胞における意図しないオフターゲット編集のリスクは否定できない。オフターゲット編集の臨床的意義は不明」と記載されています（2025年8月の主要変更）事実

8. 規制当局の考え方 ― FDA、PMDA、EMA

ここまでの内容を、各当局の文書がどう扱っているかで整理します。なお、ガイダンスは拘束力のない推奨であり、各製品の要求は個別の相談と審査で決まります。

当局・文書オフターゲット・染色体異常の評価に関する記載
FDA
ガイダンス
（2024年1月）		複数の方法（in silico、生化学的、細胞を用いる方法）でゲノム全体を対象とした解析を行い、偏りを減らす。可能なら関連するヒト細胞を複数のドナーから得て解析する。確認は低頻度の事象を検出できる感度の方法で行い、体外編集製品では最終製品を複数ドナーで評価する。適切な対照を含める。染色体異常、挿入・欠失、腫瘍原性・挿入変異、クローン拡大の評価。出荷試験にオフターゲット編集頻度や染色体の再編成を含める必要があるかは非臨床の結果による。長期追跡は最長15年を推奨
FDA
CASGEVY審査要約
（2023年12月8日）		最も重要な特定リスクはCRISPR/Cas9によるオフターゲット編集の可能性で、現時点では不明。承認の条件として、250人のSCD患者を15年追跡する観察研究（研究終了予定2042年12月31日、最終報告2043年12月31日）と、遺伝的多様性の影響を評価する生物情報学的研究を要求。拡張した医薬品安全性監視として、二次がんとオフターゲット編集に伴う臨床症状の15日以内の迅速報告。REMS（リスク評価・緩和戦略）は不要と判断
EMA
CASGEVY EPAR
（2024年）		非臨床でin silicoとGUIDE-seqで候補を挙げ、ハイブリッドキャプチャで確認。核型分析、LR-PCRなどでオンターゲットと染色体の評価。条件付き販売承認で、長期追跡試験（最長15年）を含む特定の義務が課された
PMDA科学委員会報告書
（2020年2月）		in silico解析だけでなく、実験的手法でヒトゲノム全体にわたる候補を探す。全ゲノムシーケンスやアンプリコンシーケンスで確認。0.1%以下は極めて困難。種差のため動物でのオフターゲット評価は困難で、ヒト細胞を用いたin vitro試験が必要。染色体解析（Gバンド、mFISH、CGH）にはそれぞれ検出できる範囲の限界がある。造血幹細胞やiPS／ES細胞は、分化した細胞よりがん化リスクが高いと想定される。長期フォローアップの必要性を指摘

すべて事実（参考資料1〜4）。FDA審査要約の市販後研究の日付は2023年12月時点の計画で、現在の進捗は本稿では確認していません（未確定／将来）。並べ方は本記事による整理で、各当局の要求の優劣を示すものではありません。

9. 低減の工夫 ― ガイド、酵素、時間、方式

オフターゲットを減らす工夫は、大きく4つのてこに整理できます（本記事による整理）。 FDAのガイダンスも、ガイドRNAなどの部品を、オフターゲットを減らすよう最適化することを求めています事実。

オフターゲットを減らす4つのてこ（概念図） ※ 数値は各論文の実験条件でのもので、製品の安全性を保証するものではありません。 ① ガイドRNAの設計 20塩基より短いガイドで 一部の部位のオフター ゲット変異を5,000倍以上 低減（標的の効率は維持） Fuら 2014 候補の少ない配列を選ぶ in silico設計が最も重要 （PMDA報告書） 全部位に効くとは限らない ② 酵素の改変 eSpCas9：構造に基づく 改変（Slaymakerら） SpCas9-HF1：非特異的な DNA接触を減らす （Kleinstiverら） HiFi Cas9（R691A）： RNPでも活性を保つ （Vakulskasら） 活性とのトレードオフに注意 ③ 存在する時間 RNPは導入後すぐに切断し 速やかに分解される （Kimら 2014） FDA：持続時間は必要な 時間まで最小化する ウイルスベクターでは 発現の持続性を解析 （PMDA報告書） 効果と引き換えにならないか ④ 編集方式 切らない編集で、二本鎖 切断に由来する問題を回避 ただし固有の懸念： DNA：マウス胚でCBEの SNVが20倍超（Zuoら） RNA：転写産物に多数の C→U変換（Grünewaldら） 改変体で大きく低減 新しい種類の評価が必要 ※ 4つは独立ではなく、組み合わせて使われます。製品ごとに最適な組み合わせは異なり、優劣を示すものではありません。 ※ CBE＝シトシン塩基編集。SNV＝一塩基変異。
図7　概念図（ベクター作図）。各項目は Fuら（2014）［参考資料7］、Slaymakerら（2016）［参考資料20］、Kleinstiverら（2016）［参考資料21］、Vakulskasら（2018）［参考資料22］、Kimら（2014）［参考資料23］、Zuoら（2019）［参考資料26］、Grünewaldら（2019）［参考資料27］、FDAガイダンス［参考資料1］、PMDA報告書［参考資料2］の記述によります。4つに整理したのは本記事によるものです。
てこ論文要旨の記述
短縮ガイドRNA
（Fuら 2014）		標的配列と相補的な領域が20塩基未満の短縮ガイドRNAは、一部のオフターゲット部位での望ましくない変異を5,000倍以上減らせ、標的での編集効率は損なわない。GUIDE-seqの報告でも、短縮ガイドRNAでRGN誘導のオフターゲットDSBが大きく減った
eSpCas9
（Slaymakerら 2016）		構造に基づくタンパク質工学でSpCas9の特異性を改良。ヒト細胞で、オフターゲットを減らしつつ強いオンターゲット切断を維持
SpCas9-HF1
（Kleinstiverら 2016）		非特異的なDNA接触を減らすよう設計。試験したsgRNAの85%超でオンターゲット活性が野生型と同等。標準的な非反復配列を標的にしたとき、ゲノム全体の切断検出法と標的シーケンスでオフターゲットのほぼすべてが検出不能に。反復的な標的では、野生型で見られた大半が検出されなかった
HiFi Cas9
（Vakulskasら 2018）		従来の高忠実度変異体は、治療に関連するRNP送達ではオンターゲット活性が低下した。細菌でのスクリーニングで点変異p.R691Aを得て、オンターゲット活性を保ったままオフターゲット編集を減らした。ヒトCD34陽性細胞とT細胞の5つの遺伝子座で遺伝子標的化を確認
RNPの導入
（Kimら 2014）		RNPは導入後ほぼ直ちに切断し細胞内で速やかに分解されるため、プラスミド導入と比べオフターゲット変異を低減。多能性幹細胞への負担も小さい
プライム編集
（Anzaloneら 2019）		既知のCas9オフターゲット部位で、Cas9ヌクレアーゼよりはるかに少ないオフターゲット編集を示した
塩基編集の固有の懸念Zuoら：GOTI法で、Cas9とアデニン塩基編集のオフターゲットSNVは自然突然変異率に近かったが、シトシン塩基編集では20倍超の頻度でSNVが入った（マウス胚）。Grünewaldら：ラットAPOBEC1を用いたCBEが、発現遺伝子の38〜58%で数万か所のRNAのC→U編集を起こし、改変体で390倍超・3,800倍超減らせた。アデニン塩基編集もRNA編集を起こしうる

すべて事実（参考資料7・8・20〜28の要旨）。数値は各論文の実験条件（培養細胞、マウス胚など）での結果です。

10. 素材技術者の視点②：低減策は「材料設計」の問題

素材技術者の読みどころ：特異性と活性のトレードオフは、使う「形」で評価し直す必要がある

Vakulskasらの論文には、材料開発者に馴染みのある教訓があります。 既存の高忠実度Cas9変異体は、治療に関連するRNP送達の形では、オンターゲット活性が低下したというのです事実。 彼らはRNPの形でも活性を保つ変異体を探すために、細菌でのスクリーニング系を作り、単一の点変異（R691A）を得ました事実。 つまり、酵素の性能は、プラスミドで発現させたときの値ではなく、製品として使う「形」（RNP）で評価しなければならないということです（本記事による解説）。

  • 「接触を減らす」設計：SpCas9-HF1は、非特異的なDNA接触を減らすよう設計されています事実。標的との完全一致でのみ切断が成立するよう、結合の余裕を削ぐ設計と読めます（本記事による解釈）。材料の世界で言えば、しきい値を鋭くする設計です
  • パラメータとしての配列長：ガイドRNAの標的相補領域を20塩基から短くするのは、化学合成するオリゴヌクレオチドの設計パラメータを動かす操作です。EMAの報告書によれば、CASGEVYのガイドRNAは100-merの合成品で、合成条件と精製条件の最適化で純度を上げています事実。配列設計と不純物管理の両方が、製品の特異性に効きます（本記事による解説）
  • RNPという「使い捨ての形」：RNPは導入後すぐ分解されることが利点ですが、その分、導入できる細胞の種類と条件が制約されるという側面もあります。電気穿孔の条件、細胞との混合順序、RNPを調製してから使うまでの時間は、EMAの報告書でも工程パラメータとして扱われています事実（RNPは電気穿孔の直前に調製される）

CASGEVYで使われるCas9が高忠実度型かどうかは、本稿が参照した規制資料（FDA審査要約、EMA報告書、添付文書）では確認できませんでした。 規制資料に記載されているのは化膿レンサ球菌由来のCas9という点までです未確定／将来。

11. 課題と、確定していないこと

(1) 検出限界は、方法の限界でもある

第4章で見たとおり、閾値以下の頻度は「見えていない」状態です。PMDAは0.1%以下の検出は極めて困難としています。検出の感度を上げるほど、サンプル（細胞数・DNA量）と費用が必要になります事実。

(2) 個人差を、どこまで網羅できるか

FDAの審査要約は、変異データベースが限られた人数の配列に基づくことを問題にし、追加の研究を求めました。 どの範囲の集団・頻度の変異を評価対象にするかは、規制当局もなお議論している領域です（FDAは0.5%以上のアレル頻度を例示）事実。

(3) 評価法の標準化

FDAのガイダンスは単一の方法ではなく複数の方法の併用を推奨しており、特定の「標準法」は示していません。EMAの報告書でも、確認の閾値は試験によって1%から0.2%に変わっています事実。 オフターゲット評価の共通の標準物質・標準手順が整備されているかは、本稿の調査範囲で確認できませんでした。

(4) 体内（in vivo）編集の評価

PMDAの報告書は、ヒトと動物でゲノムの塩基配列に種差があるため、オフターゲット作用を動物で評価するのは困難であり、ヒト細胞を用いたin vitro試験で詳細に解析する必要があるとしています。 in vivoでは、株化細胞よりも初代細胞を用いた解析が望ましく、iPS細胞やES細胞由来の細胞も有用と考えられる、とされています事実。 DISCOVER-seqは、マウスの体内（アデノウイルスによる編集）での同定が示されていますが、ヒトの体内での検出法は確立途上です事実。

(5) 長期の影響

添付文書は、オフターゲット編集の臨床的意義は不明としています。FDAのガイダンスは最長15年の追跡を推奨し、CASGEVYでは15年間の長期追跡試験（ClinicalTrials.gov NCT04208529）が登録されています事実。 市販後研究の結果が出るのは、早くても数年〜十数年先です未確定／将来。

この記事のまとめ
  • 「意図しない編集」は4種類あります。類似配列でのオフターゲット、標的部位の大きな欠失・再編成、染色体レベルの異常、細胞応答（p53）による選択です事実
  • 評価は2段階です。候補を挙げ（in silico、試験管内、細胞内）、候補を深いシーケンスで確認します。方法ごとに見える範囲が違います事実
  • 「見つからなかった」は、検出限界つきの主張です。閾値0.2%・深さ10,000×は期待20本、ゼロ件でも上限は約0.03%で、数十万アレル規模が下に隠れうる本稿の計算
  • CASGEVYの非臨床評価では、確認されたオフターゲット編集はありませんでした。一方で添付文書は、遺伝的変異によるオフターゲット編集の可能性は否定できないとしています事実
  • 個人差が結果を変えます。変異がPAMを作る例が報告され、FDAは生物情報学的研究を要求しました事実
  • 低減策は材料設計の問題です。ガイド、酵素、時間、方式のてこがあり、酵素の性能は使う「形」（RNP）で評価する必要があります事実
  • 長期追跡が前提です。FDAは最長15年の追跡を推奨し、承認でも15年の観察研究を要求しました事実

12. 用語集

オフターゲット
狙った場所以外の類似配列で起こる意図しない編集。
オンターゲット
狙った場所。ここでの大きな欠失や再編成も「意図しない結果」に含まれる。
ノミネーション
オフターゲットの候補部位を挙げる段階。
in silico
コンピュータ上の解析。参照ゲノムの配列の類似性から候補を予測する。
GUIDE-seq
二本鎖オリゴDNAを切断部位に取り込ませて、細胞内で切れた場所を読み出す方法。
CIRCLE-seq／CHANGE-seq
環状化・タグメンテーションしたゲノムDNAをCas9で試験管内で切り、切断部位を読む方法。
Digenome-seq
Cas9で消化したゲノムを全ゲノムシーケンスし、切断部位を探す方法。
DISCOVER-seq
DNA修復因子MRE11の動員を追跡して、細胞内・生体内の切断部位を探す方法。
ハイブリッドキャプチャ
候補部位に対応するプローブで該当領域だけを濃縮して深く読む方法。
カバレッジ（深さ）
ある位置を何本のリードで読んだか。深いほど低頻度の変化を見つけやすい。
クロモスリプシス
1本または数本の染色体に限って起こる、広範な再編成。
p53
DNA損傷に応答して細胞周期停止や細胞死を起こす、がん抑制遺伝子産物。
マイナーアレル頻度（MAF）
集団の中で、少ない方のアレルがもつ頻度。
高忠実度Cas9
オフターゲットを減らすよう改変されたCas9（eSpCas9、SpCas9-HF1、HiFi Cas9など）。
核型分析
分裂中期の染色体を観察し、数や大きな構造の異常を調べる方法。
長期フォローアップ
投与後に長期にわたり安全性を追跡すること。ゲノム編集ではFDAが最長15年を推奨。

13. 参考資料（一次情報）

  1. 米国FDA「Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing — Guidance for Industry」2024年1月（PDF） — fda.gov
  2. PMDA 科学委員会「ゲノム編集技術を用いた遺伝子治療用製品等の品質・安全性等の考慮事項に関する報告書」2020年2月7日（PDF。ファイルの冒頭に報告書の目次あり） — pmda.go.jp
  3. 米国FDA CBER「Summary Basis for Regulatory Action — CASGEVY（BLA STN 125787）」2023年12月8日（PDF） — fda.gov
  4. EMA「Casgevy — EPAR Public assessment report」EMA/6332/2024（PDF） — ema.europa.eu
  5. EMA「Casgevy — European public assessment report（EPAR）」製品ページ — ema.europa.eu
  6. 米国FDA「CASGEVY 添付文書（Prescribing Information）」2026年7月改訂（PDF） — fda.gov
  7. Fu Y ほか「Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs」Nat Biotechnol 32(3):279-284 (2014). doi:10.1038/nbt.2808 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  8. Tsai SQ ほか「GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases」Nat Biotechnol 33(2):187-197 (2015). doi:10.1038/nbt.3117 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  9. Tsai SQ ほか「CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets」Nat Methods 14(6):607-614 (2017). doi:10.1038/nmeth.4278 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  10. Lazzarotto CR ほか「CHANGE-seq reveals genetic and epigenetic effects on CRISPR-Cas9 genome-wide activity」Nat Biotechnol 38(11):1317-1327 (2020). doi:10.1038/s41587-020-0555-7 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  11. Kim D ほか「Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells」Nat Methods 12(3):237-243 (2015). doi:10.1038/nmeth.3284 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  12. Wienert B ほか「Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq」Science 364(6437):286-289 (2019). doi:10.1126/science.aav9023 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  13. Kosicki M ほか「Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements」Nat Biotechnol 36(8):765-771 (2018). doi:10.1038/nbt.4192 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  14. Cullot G ほか「CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations」Nat Commun 10:1136 (2019). doi:10.1038/s41467-019-09006-2 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  15. Leibowitz ML ほか「Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing」Nat Genet 53(6):895-905 (2021). doi:10.1038/s41588-021-00838-7 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  16. Zuccaro MV ほか「Allele-specific chromosome removal after Cas9 cleavage in human embryos」Cell 183(6):1650-1664 (2020). doi:10.1016/j.cell.2020.10.025 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  17. Haapaniemi E ほか「CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response」Nat Med 24(7):927-930 (2018). doi:10.1038/s41591-018-0049-z — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  18. Ihry RJ ほか「p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells」Nat Med 24(7):939-946 (2018). doi:10.1038/s41591-018-0050-6 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  19. Cancellieri S ほか「Human genetic diversity alters off-target outcomes of therapeutic gene editing」Nat Genet 55(1):34-43 (2023). doi:10.1038/s41588-022-01257-y — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  20. Slaymaker IM ほか「Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity」Science 351(6268):84-88 (2016). doi:10.1126/science.aad5227 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  21. Kleinstiver BP ほか「High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects」Nature 529(7587):490-495 (2016). doi:10.1038/nature16526 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  22. Vakulskas CA ほか「A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells」Nat Med 24(8):1216-1224 (2018). doi:10.1038/s41591-018-0137-0 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  23. Kim S ほか「Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins」Genome Res 24(6):1012-1019 (2014). doi:10.1101/gr.171322.113 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  24. Komor AC ほか「Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage」Nature 533(7603):420-424 (2016). doi:10.1038/nature17946 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  25. Gaudelli NM ほか「Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage」Nature 551(7681):464-471 (2017). doi:10.1038/nature24644 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  26. Zuo E ほか「Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos」Science 364(6437):289-292 (2019). doi:10.1126/science.aav9973 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  27. Grünewald J ほか「Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors」Nature 569(7756):433-437 (2019). doi:10.1038/s41586-019-1161-z — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  28. Anzalone AV ほか「Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA」Nature 576(7785):149-157 (2019). doi:10.1038/s41586-019-1711-4 — pubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  29. ClinicalTrials.gov「A Long-term Follow-up Study in Participants Who Received CTX001（NCT04208529）」 — clinicaltrials.gov

14. 主張と出典の対応表（監査）

本文の主張根拠区分
FDAガイダンスの記載：ゲノム編集特有のリスク（オフターゲット編集、オンターゲット編集の意図しない結果、長期影響が不明）、DSBが染色体再編成（転座を含む）を起こしうること、複数手法（in silico、生化学的、細胞を用いる方法）でゲノム全体を対象に解析すること、関連するヒト細胞を複数ドナーから得ること、低頻度事象を検出できる感度の方法で検証すること、体外編集製品では最終製品を複数ドナーで評価すること、適切な対照を含めること、染色体異常・挿入欠失・腫瘍原性・クローン拡大の評価、出荷試験にオフターゲット編集頻度や染色体再編成を含める可能性、部品の最適化、長期追跡は最長15年、持続時間の最小化FDA ガイダンス（2024年1月）［参考資料 1］https://www.fda.gov/media/156894/download事実
PMDA報告書の記載：ガイドRNAは最大5個のミスマッチでも結合しうること、オフターゲットの結果として懸念されるのはがん化であること、DSBでは従来の評価法で検出できない大規模欠損等が報告されていること、in silicoに加え実験的手法でヒトゲノム全体を探すこと、全ゲノムシーケンスやアンプリコンシーケンスによる確認、NGSの誤り率のため0.1%以下は極めて困難、検出方法の表（in silicoは容易だが不正確、全ゲノムは正確だが高価で低感度、試験管内は高感度でSNPを区別できるが細胞内ではない）、動物での評価が困難、数kbの大きな欠失・挿入・逆位、Gバンド・mFISH・CGHの限界、p53変異の報告、造血幹細胞・iPS／ES細胞のがん化リスクが高いと想定されること、in vivoでは初代細胞やiPS／ES由来細胞の利用、長期フォローアップPMDA 科学委員会報告書（2020年2月7日）［参考資料 2］https://www.pmda.go.jp/files/000265952.pdf事実
FDA審査要約の記載：主要リスクはCRISPR/Cas9のオフターゲット編集の可能性で現時点で不明、非臨床で候補部位をハイブリッドキャプチャで確認しオフターゲット編集は検出されず、遺伝的多様性を考慮した解析は限られた人数のデータベースによるもので一部の変異のみ実験的に試験（サンプルの制約）、市販後の生物情報学的研究（5大陸集団の少なくとも1つで0.5%以上のアレル頻度の変異を用いた解析と確認試験）、250人のSCD患者を15年追跡する観察研究（研究終了予定2042年12月31日、最終報告2043年12月31日）、二次がんとオフターゲットに伴う臨床症状の15日以内の報告、REMS不要、諮問委員会（2023年10月31日、投票設問なし、CPS1変異のスクリーニング等を議論）FDA 審査要約（SBRA、2023年12月8日）［参考資料 3］https://www.fda.gov/media/175179/download?attachment事実
EPARの記載：候補の抽出と確認の2段階、in silicoツール（CCTop、CRISPOR、COSMID）とミスマッチ数、GUIDE-seqの条件（dsODN濃度1 µM超で毒性、857か所、0.5 µMで生存率70%以上、別2ドナーで21領域、重複なし、5,007か所のin silico、52領域→142候補）、患者細胞での64領域、ハイブリッドキャプチャ（閾値1%・中央値カバレッジ2,500超、後に0.2%・10,000×超、223か所・4ドナー）、患者細胞で4領域・2つが名目上有意で申請者は真のオフターゲットとみなさない理由、7ロットでの評価、いずれの試験でも確認されたオフターゲット編集なし、大きな挿入・欠失の割合（LR-PCR 4.0%・6.3%、ハイブリッドキャプチャ4.7%・4.9%、最大約7.5 kb・5.5 kb）、核型分析（240細胞中60細胞が処理、5細胞に異常、4細胞は染色体喪失で対照にもあり）、MAF 10%超・1%超のSNP、候補の多くはイントロンまたは遺伝子間領域、条件付き承認と長期追跡の義務、ガイドRNAが100-merで合成条件・精製条件の最適化により純度向上、RNPは電気穿孔の直前に調製EMA 公開審査報告書 EMA/6332/2024［参考資料 4］https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/casgevy-epar-public-assessment-report_en.pdf事実
CASGEVYの添付文書5.4項（遺伝的変異のためオフターゲット編集のリスクは否定できず臨床的意義は不明、2025年8月の主要変更）、最小推奨用量3×10⁶ CD34陽性細胞／kgFDA 添付文書［参考資料 6］https://www.fda.gov/media/174615/download?attachment事実
標的と最大5塩基違う部位に変異が入りうること、短縮ガイドRNAで一部のオフターゲット変異を5,000倍以上減らせることFuら（2014）要旨［参考資料 7］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24463574/事実
GUIDE-seq、CIRCLE-seq、CHANGE-seq、Digenome-seq、DISCOVER-seqの原理と結果（表の記述）Tsaiら（2015）［参考資料 8］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25513782/、Tsaiら（2017）［参考資料 9］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28459458/、Lazzarottoら（2020）［参考資料 10］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32541958/、Kimら（2015）［参考資料 11］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25664545/、Wienertら（2019）［参考資料 12］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31000663/事実
標的部位での数kb規模の欠失・複雑な再編成、メガベース規模の染色体の切り詰め（p53依存）、クロモスリプシス、ヒト胚での染色体の腕の喪失Kosickiら（2018）［参考資料 13］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30010673/、Cullotら（2019）［参考資料 14］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30850590/、Leibowitzら（2021）［参考資料 15］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33846636/、Zuccaroら（2020）［参考資料 16］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33125898/事実
Cas9編集によるp53依存のDNA損傷応答と選択、多能性幹細胞でのCas9のDSBの毒性とP53依存性、80%超の平均インデル効率、p53機能のモニタリングの推奨Haapaniemiら（2018）［参考資料 17］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29892067/、Ihryら（2018）［参考資料 18］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29892062/事実
BCL11Aエンハンサー標的ガイドRNAの最有力オフターゲット候補が、アフリカ系で一般的なアレル（MAF 4.5%）により作られたPAMによること、アレル特異的インデルと動原体周辺の逆位、高忠実度Cas9による軽減Cancellieriら（2023）要旨［参考資料 19］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36522432/事実
eSpCas9、SpCas9-HF1、HiFi Cas9（R691A）、RNP導入の記述と数値Slaymakerら（2016）［参考資料 20］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26628643/、Kleinstiverら（2016）［参考資料 21］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26735016/、Vakulskasら（2018）［参考資料 22］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30082871/、Kimら（2014）［参考資料 23］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24696461/事実
塩基編集・プライム編集の固有のオフターゲット（マウス胚でCBEのSNVが20倍超、RNA編集、390倍超・3,800倍超の低減、プライム編集のオフターゲットが少ないこと）Zuoら（2019）［参考資料 26］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30819928/、Grünewaldら（2019）［参考資料 27］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30995674/、Anzaloneら（2019）［参考資料 28］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31634902/、Komorら（2016）［参考資料 24］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27096365/、Gaudelliら（2017）［参考資料 25］https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29160308/事実
CASGEVYの長期追跡試験（15年）がClinicalTrials.govに登録されていることClinicalTrials.gov NCT04208529［参考資料 29］https://clinicaltrials.gov/study/NCT04208529事実
FDA審査要約に記載された市販後研究の完了予定日、およびその結果（出るのは数年〜十数年先）2023年12月時点の計画であり、現在の進捗は確認していない。結果は出ていない未確定／将来
CASGEVYで使われるCas9が高忠実度型かどうか、オフターゲット評価の公的標準物質の有無、共通の標準手順の有無本稿が参照した規制資料・文献では確認できなかったため、記載していない未確定／将来
期待リード数（25・20・10・5本）、ポアソン分布による5本以上の確率（約97%・約56%）、3の法則による上限（約0.03%・約0.12%）、1.8×10⁸個・3.6×10⁸アレル、7.2×10⁵・1.1×10⁵アレルへの換算本稿の計算。シーケンスの誤りを無視し、体重60 kg、二倍体、評価部位1か所を仮定した理想化で、実際の検出能力や安全性を示すものではない本稿の計算
「意図しない編集」を4種類に整理したこと。低減策を4つのてこに整理したこと。dsODN濃度と候補リストの関係、対照の役割、高忠実度酵素の「しきい値を鋭くする」設計、RNPの形での評価が必要という読み取り。期待20本が誤りと区別できる程度という解釈公表内容にもとづく本記事の整理・解説。各機関が表明した見解ではない解説
図1・図2・図3・図4・図6・図7が説明のための作図であること。ヒーロー画像と図5がAI生成イメージであること本記事による注記解説

最終更新：2026年10月1日／出典は一次情報（規制当局の公表資料、公開審査報告書、査読論文）に限定しています。 構造の整理や評価設計上の読み取りを含むため、それらは「解説」として出典付きの事実と区別しています。 CASGEVYのCas9が高忠実度型か、オフターゲット評価の公的標準物質や共通の標準手順、市販後研究の結果については、公開された一次情報で確認できなかったため、断定していません。 第4章の計算は誤りを無視した理想化で、実際の検出能力を保証するものではありません。 図はすべて説明用の概念図です。図1・図2・図3・図4・図6・図7はベクター作図、ヒーロー画像と図5はAI生成イメージであり、いずれも実際の分子構造・顕微鏡像・シーケンスデータ・製品の実物を示すものではありません。